中国·(31399)金沙娱场城-Master Platform

目的    建立氢氧化铝佐剂细菌内毒素的重组C因子检测方法。

方法   参照中国药典2020年版四部载录的重组C因子法，通过灵敏度试验、标准曲线可靠性验证、稀释法排除干扰、重复试验，建立氢氧化铝佐剂的内毒素定量检测方法。

结果   通过灵敏度试验，筛选出合适的96孔反应微板。标准曲线可靠性验证试验检测3批试剂，决定系数均大于0.980。干扰试验中通过稀释法排除氢氧化铝对检测的干扰。对Alhydrogel® 2％、国药中生生物技术研究院生产的氢氧化铝佐剂进行3次重复试验，未检测到内毒素。检测这两个生产厂家的氢氧化铝佐剂共13批，回收率均在50％～200％范围内，结果符合中国药典规定。

结论  重组C因子法检测氢氧化铝佐剂具有良好的灵敏度、可靠性、重复性及抗干扰能力，可应用于氢氧化铝佐剂的细菌内毒素检测。

      铝佐剂已广泛应用于人用疫苗80余年，其安全性和有效性均得到了充分验证。Alhydrogel®佐剂是目前国际公认的标准氢氧化铝佐剂[1-3]。中国药典2020年版四部（药典四部）对于氢氧化铝佐剂内毒素含量有明确要求，应小于每毫克铝5 内毒素单位（endotoxin unit，EU）[4]。各种铝佐剂和含铝佐剂疫苗的制备过程不一，铝离子及其胶体特性对一些检测方法有干扰，因此在建立细菌内毒素检查方法的过程中需进行方法适用性考察[5-7]。

      C因子为激活鲎试剂凝固级联反应时的第1个组分，可选择性识别细菌内毒素。重组C因子法采用人工表达的C因子，无需鲎原料，同时具有灵敏度高、抗干扰能力强、高通量、可定量检测等优点[8-10]，2013、2020、2021年先后被美国、中国、欧洲药品监管部门接受为内毒素检查法[4, 11-12]。本研究采用国产试剂，探索重组C因子法检测氢氧化铝佐剂细菌内毒素方法及干扰情况，建立检测方法。

      进口Alhydrogel® 2％氢氧化铝佐剂购自丹麦Brenntag Biosector公司，铝含量10 mg/ml，尚未建立鲎试剂凝胶检测内毒素方法，生产厂家采用的热原检查法为家兔法，参照药典四部要求，合格标准为50 EU/ml；国产氢氧化铝佐剂由国药中生生物技术研究院有限公司第六研究室提供，经鲎试剂凝胶法检测细菌内毒素合格，参照药典四部要求，合格标准为3 EU/ml。

      3批重组C因子内毒素检测试剂盒购自苏州瑞安生物科技有限公司，批号分别为RF010201203、RF010210402、RF010210403。

        用内毒素检查用水将试剂盒中内毒素工作标准品进行系列稀释，加入微板，100 μl/孔，每个浓度设2~6个复孔，37 ℃孵育15 min。将荧光底物、缓冲液、重组C 因子酶按5∶4∶1混合，加入微板中，100 μl/孔，振荡15 s，37 ℃孵育，于0和1 h时用荧光微板检测系统读数。计算每孔在0和1 h时相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）之差的对数lgΔRFU。

1.4.1 灵敏度验证    配制浓度为0.5 EU/ml的内毒素工作标准溶液，设6个复孔。设置仪器参数：激发、发射波长380 nm和440 nm，温度37 ℃，2次读数之间间隔1 h，光学位置为顶部，仪器增益值为自动。结果判断标准：lgΔRFU均值在3.5~4.0。选取3种96孔反应微板进行试验。

1.4.2 标准曲线可靠性验证    采用3批内毒素检测试剂盒，分别配制浓度为5×10^-3~5×10⁰ EU/ml的内毒素工作标准溶液，阴性对照为内毒素检查用水。每个浓度的内毒素工作标准溶液和阴性对照做3个复孔。完成后按公式计算每孔的lgΔRFU，标准品和样品与阴性对照孔的 ΔRFU 之差为净 ΔRFU值，以净 ΔRFU对数对内毒素浓度对数进行线性拟合，标准曲线精密度要求：决定系数（R²）应大于等于0.980。

1.4.3 干扰试验    每次试验均按1.4.2方法作标准曲线。在供试品阳性对照中添加0.5 EU/ml的内毒素工作标准溶液。供试品采用不同稀释浓度以排除干扰。每个试验做2复孔，进行干扰试验研究。计算样品及加标样品的内毒素浓度，按下列公式计算加标回收率，若加标回收率在 50%~200%之间则认为样品对检测无干扰，结果可靠。

1.4.4 重复试验    按1.4.3方法将进口、国产氢氧化铝佐剂分别稀释4 000、400倍，进行3次重复试验，作标准曲线，计算样品及加标样品的内毒素浓度、加标回收率。

1.4.5 细菌内毒素检测    采用进口、国产氢氧化铝佐剂共13批，均按1.4.4项方法分别稀释4 000、400倍，作标准曲线，计算样品及加标样品的内毒素浓度、加标回收率。当标准曲线R2≥0.980、样品加标回收率在 50%~200%之间、内毒素浓度分别低于50和3 EU/ml时，判定内毒素检测合格。

     货号966、6005181的微板lgΔRFU值分别为2.63、3.19，不满足灵敏度验证的要求（3.5~4.0）。货号136101的微板lgΔRFU值为3.58，可用于检测。

       取阴性对照、4个浓度工作标准品做3复孔，内毒素浓度在5×10^-3~5×10⁰  EU/ml时，标准曲线R²为0.999，线性良好（图1）。    

        对3批重组Ｃ因子试剂进行标准曲线可靠性验证，R²分别为0.999、0.982、0.996，均大于等于0.980（图2）。结果证明试剂、试验条件可靠。

        重组C因子法26次试验R²均在0.980以上，均值为0.996，具有良好的精密度。

      进口氢氧化铝佐剂在10、100、1 000、2 000倍稀释后，加标回收率为0.0%、0.0%、2.2%、7.6%，表明存在抑制作用，即存在干扰。在4 000倍稀释后，加标回收率为64.4%，排除了干扰。国产氢氧化铝佐剂在10、100、200倍稀释后，加标回收率为0.0%、0.0%、23.6%，表明存在抑制作用，即存在干扰。在400倍稀释后，加标回收率为55.0%，排除了干扰（表1）。

       进口、国产氢氧化铝佐剂分别稀释4 000、400倍，进行3次重复试验。标准曲线可靠性符合要求；样品加标回收率均在50％～200％范围内，无干扰；内毒素定量检测结果低于限值，根据药典四部可判定合格。结果重复性良好（表2）。

      内毒素检测结果见表3，检测2个厂家的氢氧化铝共13批，标准曲线可靠性符合要求，样品的加标回收率均在50％～200％范围内，无干扰，细菌内毒素定量检测值均低于合格标准，可判定合格，符合药典四部规定。表明所建立的排除干扰方法可用于重组C因子法检测，且重复、适用性良好，可用于氢氧化铝佐剂日常质量控制。

       本试验根据药典四部“细菌内毒素检查法应用指导原则” [9]，并参照相关文献[13-14]，对重组C因子法检测氢氧化铝佐剂内毒素进行方法适用性研究，结果显示灵敏度、可靠性、精密度、重复性良好。试验中发现用于荧光检测的96孔反应微板除满足无菌、无热原等要求外，还需进行验证筛选。欧洲药典中要求对每批重组Ｃ因子试剂均需进行标准曲线可靠性验证，其亦是各国药典中规定的方法转移验证，用以证明该实验室可以操作重组Ｃ因子法[9-11]。按药典四部要求，标准曲线R2应大于等于0.980，验证3批重组Ｃ因子试剂的R2均大于0.980，证明试剂、试验条件可靠。

       重组Ｃ因子法因采用了荧光反应，不能直接使用其他方法干扰试验的结论，加之生物制品的成分复杂，不同品种的供试品必须进行干扰试验。通过重组C因子法检测不同稀释倍数的氢氧化铝佐剂，排除了氢氧化铝自身性质引起的干扰，并通过重复试验及对13批氢氧化铝佐剂的检测建立具体检测方法，解决了氢氧化铝佐剂采用鲎试剂凝胶法检测有干扰的问题^[15]。

      重组C因子法采用仪器定量检测，每次试验均可定量观察到样品的干扰或增强情况，只需对3批新产品进行试验，根据结果即可快速建立方法。其高通量、快速的特性也更适用于检测生物制品成分复杂的原料、半成品、成品，满足研发、生产疫苗快速、准确的需求。本研究表明重组C因子法适用于氢氧化铝佐剂的细菌内毒素检测，值得进一步推广应用。

参考文献（略）

庞宇  王菲  章孟学  冯帆  刘爱平  孙成金

国药中生生物技术研究院有限公司质量检定室，北京  101111

通信作者：孙成金，

Email: schj1979@163.com

引用本文：庞宇，王菲，章孟学，等. 重组C因子法检测氢氧化铝佐剂细菌内毒素的适用性 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(5): 257-260.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220210-00011