IdeS的应用
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IdeS的介绍
免疫球蛋白 G 降解酶 (Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)，来自酿脓链球菌，是一种常见的来自 A 型链球菌的半胱氨酸蛋白酶，具有水解 IgG 的肽链内肽酶活性，它可以识别抗体的铰链区即CH1 结构域和CH2 结构域之间并特异性降解 IgG[1]。
IdeS酶切示意图
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IdeS结构特征
IdeS的晶体结构研究证实其晶体结构和半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族结构特征非常相似，其活性区的肽链可被折叠成两个结构域，其中Cys94是蛋白酶 IdeS 的关键活性位点，当突变此特异性位点后，导致 IdeS 蛋白酶活性缺失，但仍具有结合 IgG 的能力，从而阻断调理作用和吞噬作用。
IdeS蛋白氨基酸序列图示[2]
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IdeS的底物特异性
到目前为止，IgG 是 IdeS 作用的唯一底物，研究发现 IdeS 还不能作用于已知的可被其他半胱氨酸蛋白酶水解的合成产物。“Y”型的 IgG 分子是由两条相似的重链和两条相似的轻链构成，是一种大分子四聚体 (约 150KD)，每一个轻链通过一个二硫键与重链连接，而两个重链是在铰链区通过至少两个二硫键连接。IdeS作用的断裂位点位于 IgG 重链上 CH2 结构域前面即铰链区的 Gly-236 和Gly-237 之间，用 IdeS 酶切 IgG 的重链之后可以获得 F(ab)2片段和完整的两个单体 Fc 片段，与抗原结合的抗体重链 F(ab)2片段分子量大小约为 100KD，恒定区 Fc 片段的分子量大小为 25KD。
IdeS的底物特异性及酶切位点[3]
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IgG与IdeS相互作用机理
免疫球蛋白在人体免疫防御系统中起到至关重要的作用，通过特异性识别并介导专职吞噬细胞或补体系统或者二者同时作用来清除外来微生物。免疫球蛋白 Ig由识别抗原的 Fab 片段，以及通过灵活的铰链区连接的恒定区 Fc 片段组成，其中 Fc 效应区域通过结合 C1q 触发经典的补体激活途径。另外，IgG 抗体还可以通过结合细菌表面的结构，并且暴露出抗体的 Fc 区域介导与吞噬细胞携带的FcγR受体相互作用。补体的经典途径最初是通过补体因子 C1q 与 IgG 或者 IgM特异性相互作用开始，结合后引起一系列的蛋白级联反应的激活，随后导致补体因子 C3b 对免疫复合体表面的粘附。C3b 可以被吞噬细胞表面的补体受体识别，然后介导这些复合体的吞噬作用。除了具有保护性作用之外，IgG 也和疾病相关。在约 5%的人体内，其对自身免疫疾病的影响已得以证实，在如下疾病中：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，重症肌无力症，免疫性 (或自发性) 血小板减少症等。
为了避开特异性抗体 IgG 的不利因素，酿脓链球菌自身也发展出几种不同的策略来对抗 IgG 功能的干涉。酿脓链球菌自身会表达一种细胞壁锚定表面蛋白，这种能够介导蛋白-蛋白之间相互作用的成员称之为M-蛋白家族，当IgG的Fc片段与M蛋白结合后，Fc结合区域被阻，也就不能与补体因子C1q结合，，从而使之Fc介导的吞噬作用受损。另外酿脓链球菌会分泌一种内切糖苷酶 EndoS，能够水解 IgG 上保守的 N-连接寡糖，水解之后的 IgG 降低了结合 Fc 受体的能力，从而使Fc介导的吞噬作用受损。
IdeS和IgG作用模式图示[2]
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IdeS酶学性质的研究
蛋白酶IdeS发挥高活性的pH范围是 5.1~8.0，最适pH是 6.6，当pH大于 10 时，该酶仍保持一定的活性，但在酸性条件下不稳定。最适反应温度在 37℃左右，在大于热力学温度 42℃时有一定程度的降解。在 37℃，pH6.6，50mM 磷酸盐缓冲液中反应 30min 可完全切开 1μg 的 IgG 抗体 (≥95%) 所需的酶量定义为一个活性单位。
其他半胱氨酸蛋白酶相似，蛋白酶IdeS活性受蛋白酶抑制剂吲哚乙酸和碘乙酰胺的抑制，但是不同之处是，蛋白酶IdeS酶活性却不受蛋白酶抑制剂 E64、血清胱抑素的影响，以及丝氨酸、天冬氨酸、金属蛋白酶抑制剂等对IdeS酶活性也没有影响。
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IdeS酶的应用
1、用于多克隆 IgG-Fc N-糖基化和异构体分析
多克隆人免疫球蛋白 G (IgG) 糖基化的方法通常包括蛋白质消化或聚糖释放。虽然这些方法可以深入表征，但它们也会导致丢失有关某些亚类、同种异型和共同发生的翻译后修饰 (PTM) 的信息。多克隆 IgG 的高度可变性使得它们的完整质谱 (MS) 分析极具挑战性，可以使用IgG 的 Fc区域，获得N-糖基化和亚类和同种异型的其他 PTM 的综合信息。人血浆 IgG 使用 Fc 特异性分离，然后将CH2结构域用酶IdeS消化。获得的 Fc 亚基混合物通过毛细管电泳 (CE) 和亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 与 MS 联用进行分析。CE-MS 提供了不同 IgG 亚类和同种异型的分离，而 HILIC-MS 允许分离不同的糖型及其氧化变体[4]。
2、用于ADC药物平均偶联率的测定
可以将ADC药物采用IdeS酶切，从铰链区下方将抗体切开，然后还原，得到Fc/2、轻链L0，偶联一个小分子药物的轻链L1、Fd、偶联1-3个小分子药物的Fd1-Fd3，最后采用反相高效液相色谱(PR-MS)、亲水相互作用色谱与质谱联用 (HILIC-MS)进行分析[5]。
3、在抗 AAV 中和抗体存在的情况下实现体内基因治疗
基因治疗可通过AAV载体的全身给药治疗多种人类疾病的。然而，针对 AAV 衣壳的预处理中和抗体对 AAV 基因转移构成了主要限制，因为它们即使在相对较低的滴度也会阻止靶组织转导。
IdeS可以有效地裂解抗AAV抗体，从而增强 IgG 清除率，并将其在血液中的 AAV 中和活性降低到与肝细胞转导相容的水平。在 AAV 载体输注时用IdeS进行预处理是一种潜在的策略，可以在存在低至中度预先存在的抗衣壳抗体的情况下实现有效的全身基因转移，这在人类中很常见，并且可能允许重复载体给药[6]。
【参考文献】